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Nov 12, 2023

[64Cu]Cu intratecal

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 12930 (2023) Citar este artículo 280 Accesos Detalles de métricas El deterioro cognitivo relacionado con la edad se asocia con un drenaje linfático disfuncional de

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12930 (2023) Citar este artículo

280 Accesos

Detalles de métricas

El deterioro cognitivo relacionado con la edad se asocia con un drenaje linfático disfuncional del líquido cefalorraquídeo (LCR) a través de los vasos linfáticos meníngeos. En este estudio, se aplicó tomografía por emisión de positrones (PET) intratecal [64Cu]Cu-albúmina en ratones para evaluar el drenaje linfático del LCR y su variación con la edad. La PET con [64Cu]Cu-albúmina se realizó en múltiples momentos después de la inyección intratecal de [64Cu]Cu-albúmina a una velocidad de infusión de 700 nl/min en ratones adultos y de edad avanzada (de 15 a 25 meses de edad). El aclaramiento del LCR y los ganglios linfáticos paravertebrales se cuantificaron después de la inyección y durante la fase estacionaria. La fase estacionaria del día siguiente siguió al estado de perturbación inicial mediante la inyección de 6 ul (1/7 del volumen total del LCR) y el tiempo medio de eliminación del LCR del espacio subaracnoideo fue de 93,4 ± 19,7 y 123,3 ± 15,6 min en ratones adultos y ancianos ( p = 0,01), respectivamente. Si bien el porcentaje de dosis inyectada de espacio en el LCR fue mayor, la actividad de los ganglios linfáticos paravertebrales fue menor en los ratones de edad avanzada al día siguiente. La PET con [64Cu]Cu-albúmina nos permitió cuantificar el drenaje linfático del LCR en todos los niveles de la médula espinal del cerebro y visualizar y cuantificar la actividad de los ganglios linfáticos debido al drenaje del LCR. La PET con [64Cu]Cu-albúmina reveló la disminución relacionada con la edad del drenaje linfático del LCR debido a esta disminución del drenaje desde el espacio subaracnoideo, especialmente durante la fase estacionaria, en ratones de edad avanzada.

Desde el descubrimiento de los linfáticos meníngeos en 20151,2, la vía de drenaje linfático meníngeo del líquido intersticial (LSI), líquido cefalorraquídeo (LCR), se ha considerado la ruta principal para la eliminación de desechos del cerebro y la médula espinal. Esta vía es también la ruta por la que los leucocitos ingresan al LCR y, en consecuencia, al parénquima cerebral y a la médula espinal a través de la piamadre o el epéndimo que recubren el cerebro y la médula espinal3,4. Los ratones y las ratas utilizan su vía dual de drenaje a través de la cavidad nasal y los linfáticos meníngeos para la eliminación de desechos5,6,7, mientras que los humanos utilizan principalmente los linfáticos de la duramadre, no la cavidad nasal8,9,10,11. El LSI pasa a través de la glía limitante hasta el espacio perivascular, que se comunica con el espacio del LCR. Por lo tanto, cualquier residuo en el FIS se drena a los linfáticos meníngeos de la duramadre del cerebro y la médula espinal12. Esta función y disfunción del drenaje linfático13 se ha investigado en roedores utilizando macromoléculas fluorescentes14 y en humanos utilizando imágenes por resonancia magnética (IRM) con contraste de gadolinio8.

Las imágenes linfáticas/linfáticas se han realizado mediante la administración de contraste mediante cisterna magna y microscopía fluorescente o resonancia magnética en roedores12,15,16,17 o mediante administración intratecal intervertebral L4/5 y resonancia magnética en humanos8,9,10,11. Ambos enfoques nos permiten visualizar el reflujo del LCR al espacio perivascular para evaluar la función linfática y el drenaje linfático del LCR. En nuestro estudio preliminar, encontramos que la administración intra-cisterna magna de [64Cu]Cu-albúmina era demasiado invasiva para revelar los cambios sutiles en la cinética del drenaje linfático del LCR, lo que requería optimizar la cantidad y el volumen del trazador18. A diferencia de los informes iniciales que revelaron la función glifática mediante microscopía de fluorescencia en roedores12,15,17,19, informes recientes han utilizado principalmente agentes de contraste intratecal para resonancia magnética, mostrando diferencias mínimas en el reflujo desde el espacio submeníngeo al perivascular20,21,22 y evitando así el uso de resonancia magnética con contraste intratecal para evaluar la función glifática. Por el contrario, el drenaje linfático del LCR podría estudiarse mediante resonancia magnética con contraste intratecal y tomografía por emisión de positrones (PET) con cisternografía intratecal18, con alto contraste y sin antecedentes, lo que demuestra un rendimiento superior en la obtención de imágenes de los ganglios linfáticos centinela primarios y secundarios del cráneo. y a lo largo de las columnas vertebrales en roedores21,22,23.

Ahora se sabe que la contribución del drenaje linfático del LCR es obligatoria para la salud del sistema nervioso central (SNC), porque la eliminación de desechos es crucial para mantener la función del cerebro y la médula espinal. Este drenaje linfático es particularmente importante durante el sueño de ondas lentas y la anestesia (revisado en 24), que tiene un valor incremental además de la eliminación in situ de los desechos/desechos por parte de las células gliales. Las disfunciones más allá del rango de variación fisiológica asociado con el sueño tienden a ser sutiles y diminutas, como se observa en los cambios relacionados con la edad en el drenaje linfático del LCR25,26,27,28,29,30,31. Por lo tanto, el volumen de contraste intratecal debe haberse minimizado para evitar alterar la estacionariedad fisiológica, pero debe ser lo suficientemente grande para que la circulación del LCR entregue los trazadores administrados a lo largo del flujo del LCR y finalmente al exterior del SNC. El LCR comienza a fluir desde el plexo coroideo ventricular, continúa a través del acueducto/canal espinal y las cisternas, redondeando y empapando los espacios perivasculares a través de todo el espacio subaracnoideo. Luego, el LCR atraviesa la capa de células de la barrera aracnoidea del cerebro y la médula espinal para llegar al espacio extracelular meníngeo y finalmente ingresa a los canales linfáticos de la duramadre craneal/vertebral a través de diversas vías, como los espacios perineurales y durales32. Varios radionúclidos/radiofármacos, que se han utilizado clínicamente para la cisternografía con radioisótopos durante décadas, podrían usarse para obtener imágenes del drenaje linfático del LCR. En nuestro estudio preliminar, elegimos [64Cu]Cu-albúmina y establecimos protocolos PET con [64Cu]Cu-albúmina para obtener imágenes del drenaje linfático del LCR en ratones18. Este enfoque también visualizó los ganglios linfáticos centinela primarios/secundarios a lo largo del cráneo a lo largo de la columna vertebral en ratones mediante PET18 con [64Cu]Cu-albúmina.

En este estudio, corroboramos los hallazgos de nuestro estudio anterior, utilizando el protocolo antes mencionado en un modelo simple de envejecimiento en ratones y evaluamos las variaciones en el drenaje linfático del LCR con el envejecimiento mediante PET intratecal con [64Cu]Cu-albúmina para analizar visual y cuantitativamente el LCR. aclaramiento, su progreso temporal después de la inyección y retención de los ganglios linfáticos inmediatamente después de la inyección y durante la fase estacionaria. El LCR de ratón, que se repone 10 o más veces al día, se alteró inyectando 6 µl (1/7 del volumen total del LCR) de [64Cu]Cu-albúmina en 9 minutos. Después de descansar durante un día, se volvieron a tomar imágenes de los ratones para evaluar el drenaje linfático estacionario del LCR y la actividad de los ganglios linfáticos bajo un influjo/drenaje continuo propio.

Se utilizaron ratones macho C57BL/6 de 2 a 9 meses de edad como adultos, mientras que aquellos de 15 a 25 meses de edad se utilizaron como ratones envejecidos33; Se alojaron de 2 a 5 ratones por jaula con acceso a comida estándar y agua potable ad libitum. La sala de alojamiento se mantuvo a una temperatura constante de 22 a 24 °C con un ciclo de luz y oscuridad de 12/12 h. Se realizó una prueba de laberinto en Y para evaluar las diferencias de comportamiento entre grupos. Este estudio comparte una cohorte de animales con literatura publicada anteriormente18, que estableció el protocolo PET con [64Cu]Cu-albúmina para evaluar el drenaje linfático del LCR en ratones adultos. El experimento con animales fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Nacional de Seúl (SNU-200513-8-6) y todos los métodos se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas y regulaciones pertinentes del IACUC de la Universidad Nacional de Seúl y las pautas de ARRIVE (https //arriveguidelines.org). Los detalles relevantes se encuentran en las Notas complementarias.

La prueba de comportamiento se realizó en un laberinto en forma de Y bajo una iluminación tenue. Para adaptar esta prueba, se introdujeron ratones en el centro del laberinto y se les permitió visitar los tres brazos el día antes de la prueba. Para la prueba del laberinto en Y, se introdujo un ratón en el centro del laberinto y se le permitió explorarlo libremente durante 8 minutos. Para calcular la alternancia, se registraron las visitas de cada brazo cuando la extremidad y la cola estaban dentro de un brazo. El porcentaje de alternancia se calculó dividiendo el número de alternancias secuenciales de los tres brazos por el número total de alternancias posibles.

La albúmina sérica humana, con un peso molecular de 66,5 kDa, se marcó radiactivamente con [64Cu]Cu (t1/2 = 12,7 h, β+ = 655 keV 17,8 %, β‒ = 579 keV 38,4 %) utilizando un método basado en química click34 . Brevemente, (1) se secó 64Cu en solución de HCl con un flujo de nitrógeno del 5 al 10 %, (2) se añadió tampón de acetato de sodio 1 M para ajustar el pH a 5,3, (3) p-isotiocianatobencil-1,4,7 -ácido triazaciclononano-1,4,7-triacético (NOTA)-N3-1300 nmol/mL, se agregaron 10 μL y la mezcla se colocó en un bloque térmico a 60–70 °C durante 10 min, (4) etiquetado NOTA-N3 de [64Cu]Cu Se añadió NOTA-N3 a 1 mg/ml de azadibenzociclooctina (ADIBO)-albúmina (albúmina sérica humana, 66,7 kDa) y se colocó en un agitador orbital durante 10 minutos, (5) la mezcla se filtró y luego se centrifugó a 15.000 rpm durante 5 min. La eficacia de etiquetado de la albúmina [64Cu]Cu fue del 99%, como se confirmó mediante cromatografía instantánea en capa fina (ITLC), con una solución de ácido cítrico 0,1 M como disolvente de desarrollo.

La administración intratecal siguió el procedimiento utilizado para la cisternografía radioisotópica preclínica o clínica18. Brevemente, se realizó una inyección intratecal después de la palpación de la columna L4. Se realizó una incisión sagital de 1 cm de largo y se insertó una aguja a través de los músculos hasta una longitud adecuada mientras se esperaba que la cola se moviera. La inyección de [64Cu]Cu-albúmina se realizó utilizando una bomba de jeringa (Harvard Apparatus) a una velocidad de infusión de 700 nl/min, inyectando un volumen total de 6 μL con una cantidad de radiactividad que oscilaba entre 0,74 y 1,85 MBq. La aguja se mantuvo en su lugar hasta que terminó la primera sesión de imágenes. Luego, se retiró la aguja y se cerró la herida.

Se utilizó la caja de PET Genisys (Sofie Biosciences) para la adquisición de PET de cuerpo entero de PET estático en modo de lista durante 6 minutos en cada uno de los puntos de tiempo de adquisición de imágenes, que fueron 9 min, 2, 4, 6, 12 y 24 h después. -inyección para ratones adultos y 9 min, 2, 4, 6, 17 y 24 h post-inyección para ratones de edad avanzada. La inyección y la adquisición de imágenes se realizaron bajo anestesia con isoflurano, con un 3% para inducción y un 2,8% para mantenimiento con inhalación de oxígeno a 500 ml/min.

Utilizando el software MIM, se dibujaron regiones de interés (ROI) tridimensionales y se midieron los recuentos de todo el espacio subaracnoideo. Se utilizaron recuentos del espacio subaracnoideo (Figura 1 complementaria) de 9 min (h0) como sustituto de la dosis inyectada para la normalización de los recuentos de todos los demás ROI en cualquier momento dado (hn), que se expresaron como% ID. El %ID de cada punto de tiempo (hn/h0) se representó frente a los puntos de tiempo correspondientes para generar las curvas de tiempo-%ID. Utilizando el modelo exponencial de un compartimento de GraphPad Prism, se calculó la vida media (t1/2) para cada ratón. El coeficiente de determinación R2 > 0,95 mostró un buen ajuste. Se utilizó la prueba t no apareada con corrección de Welch para comparar las vidas medias entre los grupos.

Se recogió LCR de un ratón adulto, una y cuatro horas después de la inyección intratecal de [64Cu]Cu-albúmina, y se realizó ITLC utilizando el protocolo de rutina.

La prueba del laberinto en Y reveló una disminución significativa (Mann Whitney, p <0,05) en la memoria espacial entre ratones de edad avanzada en comparación con ratones adultos (Figura complementaria 2).

En la proyección de intensidad máxima (MIP), la imagen animada de un ratón (Película complementaria 1) muestra que la [64Cu]Cu-albúmina alcanzó directamente los ganglios linfáticos cervicales, los ganglios linfáticos pélvicos e incluso más lejos, a través del corazón y la probable circulación sistémica. el hígado (Fig. 1A).

Imágenes de proyección de intensidad máxima de PET de cuerpo entero después de la inyección intratecal de [64Cu]Cu-albúmina que muestran los órganos implicados en la biodistribución del trazador (A), el cambio temporal de la biodistribución en un ratón adulto (n = 7) (B), y en un ratón anciano (n = 6) (C). La barra sombreada a la derecha de (B,C) indica la concentración de actividad del trazador.

Se evaluaron visualmente imágenes de animación MIP de siete ratones adultos y seis ratones envejecidos. Las imágenes representativas individuales se muestran en la Fig. 1B, C y la Película complementaria 2. En las imágenes de 9 minutos, la actividad de la albúmina [64Cu]Cu fue intensa en el espacio subaracnoideo espinal, con una concentración de trazador insignificante en las partes craneal y más caudal de el espacio subaracnoideo, que luego se llenaron con imágenes de ratones adultos y ancianos (Fig. 1B, C).

En las imágenes de 1 a 6 h de ratones adultos (Fig. 1B), la radioactividad desapareció gradualmente de los espacios subaracnoideos cervical, torácico y lumbar en ratones adultos, mientras que la actividad hepática continuó aumentando. A las 24 h, la radioactividad del espacio subaracnoideo de estos ratones adultos casi desapareció, con retención sostenida en la región nasal, los ganglios linfáticos cervicales, los ganglios linfáticos ilíacos y sacros y el espacio subaracnoideo sacro. Por el contrario, en las imágenes de 1 a 6 h de ratones de edad avanzada (Fig. 1C), la radioactividad se eliminó más lentamente del espacio subaracnoideo cervical, torácico y lumbar que en ratones adultos. Su actividad hepática siguió aumentando, pero la intensidad fue menor en ratones de edad avanzada que en ratones adultos.

A las 24 h, la actividad retenida dentro del espacio subaracnoideo de los ratones de edad avanzada fue mayor que la de los ratones adultos. La radioactividad en la región nasal, los ganglios linfáticos cervicales, los ganglios linfáticos ilíacos y sacros y el espacio subaracnoideo sacro fue similar entre ratones adultos y ratones de edad avanzada. La actividad de los ganglios linfáticos sacros fue débil en ratones de edad avanzada, mientras que la actividad del espacio subaracnoideo fue mayor en ratones de edad avanzada que en ratones adultos en la evaluación visual.

El gráfico de líneas de tiempo versus% de ID (Fig. 2A) mostró una disminución temporal general en el% de ID de todo el espacio subaracnoideo, lo que representa el "drenaje linfático del LCR" tanto en ratones adultos como envejecidos. La vida media de eliminación media de los grupos de adultos y de edad fue de 93,4 ± 19,7 (rango de 72,3 a 122,2) y 123,3 ± 15,6 (rango de 97,9 a 141,4) minutos, respectivamente. La vida media de eliminación media para ratones de edad avanzada fue significativamente mayor (Fig. 2B) que la de ratones adultos (p = 0,01). Los% de ID para ratones de edad avanzada a las 4, 6 y 24 h después de la inyección también fueron significativamente más altos (Fig. 2C-G) que los de ratones adultos (p <0,05). La eliminación fue más lenta en los ratones de edad avanzada y la retención fue mayor en el espacio subaracnoideo en los ratones de edad avanzada que en los ratones adultos. Los parámetros de eliminación del espacio subaracnoideo en ratones individuales se muestran en la Tabla complementaria 1.

Comparación entre ratones adultos (n = 7) y envejecidos (n = 6) que muestran gráficos de líneas de tiempo-%ID para la eliminación de todo el espacio subaracnoideo (A), gráficos de barras con comparación por pares para las vidas medias de eliminación (B), y gráficos de barras con comparación por pares para% de ID en los puntos temporales coincidentes (C – G).

En ITLC, la albúmina [64Cu]Cu intacta permanece en su punto máximo en el origen, y los fragmentos de albúmina [64Cu]Cu degradados con tamaños variables alcanzaron el frente del disolvente para formar el segundo pico, lo que representa el [64Cu]Cu-NOTA desprendido y no unido. N3. Se observó un único pico en el origen de la muestra de LCR (Fig. 3A), lo que revela que la albúmina [64Cu]Cu estaba intacta en el espacio subaracnoideo 1 y 4 h después de la inyección intratecal. La albúmina [64Cu]Cu intacta de muestras de sangre y orina alcanzó su punto máximo en el origen, y los fragmentos degradados correspondientes se movieron al frente del solvente a las 1 y 4 h, y la cantidad aumentó con el paso del tiempo (Fig. 3B, C).

La radioactividad del LCR a 1 h y 4 h después de la inyección intratecal con cromatogramas para la albúmina [64Cu]Cu en los puntos de tiempo correspondientes muestran un pico único para el LCR que comprende más del 90% de la radioactividad en el origen que representó la albúmina [64Cu]Cu intacta. Por el contrario, los fragmentos degradados de [64Cu]Cu-albúmina se movieron al frente del disolvente en grado variable para las muestras de sangre y orina 1 o 4 h después de la inyección intratecal de [64Cu]Cu-albúmina.

En este estudio, utilizando PET con [64Cu]Cu-albúmina, corroboramos el drenaje linfático del LCR evaluado en estudios previos mediante imágenes fluorescentes o de contraste de resonancia magnética12,15,16,17 en ratones. Además, medimos cuantitativamente la fase temprana/aguda y tardía de este drenaje después de la administración intratecal de [64Cu]Cu-albúmina para evaluar la fase estacionaria a largo plazo de este drenaje. En la PET, el cerebro y sus surcos apenas se observaron con radiactividad; por el contrario, el espacio del LCR alrededor de la médula espinal y las cisternas craneales mantuvo la radiactividad incluso 24 h después de la inyección. La cuantificación de la radiactividad del espacio subaracnoideo reveló una mayor retención de [64Cu]Cu-albúmina en ratones de edad avanzada que en ratones adultos, y la actividad drenada del LCR se mantuvo en los ganglios linfáticos cervicales y sacros. Técnicamente, junto con la menor cantidad ajustada de volumen de inyección intratecal, el último momento de las imágenes nos permitió visualizar la fase estacionaria tardía del drenaje linfático, revelando finalmente la disminución fisiológicamente mínima, aunque definitiva, en el drenaje del LCR desde el cerebro y la médula. cordón a los ganglios linfáticos adyacentes. Proponemos que el análisis del drenaje linfático del LCR mediante PET con [64Cu]Cu-albúmina y su cuantificación un día después de la inyección intratecal es una buena herramienta para evaluar los cambios en el drenaje linfático del LCR en ratones. Además, esperamos que la evaluación del drenaje linfático del LCR mediante la combinación de PET intratecal con [64Cu]Cu-albúmina en un momento posterior con imágenes de los ganglios linfáticos sea una buena alternativa a la resonancia magnética con contraste intratecal del LCR8,9,10,11, ya que podemos utilizar un volumen de inyección y una masa de agente de contraste más pequeños para estudios fisiológicos/fisiopatológicos en humanos.

Los materiales de desecho del cerebro contribuyen al envejecimiento cerebral tanto fisiológica como patológicamente (es decir, hemorragia, neuroinflamación, traumatismo o enfermedades neurodegenerativas). Obviamente, primero se eliminan del parénquima cerebral hacia el LCR dentro de los ventrículos cerebrales y el espacio subaracnoideo21,32,35,36,37, y luego se eliminan a través de los vasos linfáticos meníngeos craneales y espinales hasta los ganglios linfáticos sistémicos1,2,6,12. 15,16,19,23,27,35,38,39. Este proceso de eliminación distintivo, que se extiende a lo largo de todo el cráneo y la columna, se conoce como drenaje linfático del LCR. Debido a que los linfáticos meníngeos del cerebro/médula espinal están asociados con ganglios linfáticos pericraneales/vertebrales, cervicales16,19,23 o sacros27,38, las vías de drenaje linfático del LCR presumiblemente están separadas de los segmentos del cerebro o de la médula espinal. Los desechos tomarían diferentes caminos de eliminación desde el cerebro y la médula espinal en su camino más fácil y más corto, y estos caminos también funcionan como una interfaz neuroinmune entre el sistema inmunológico central (es decir, la médula ósea) y el sistema nervioso central (cerebro y médula espinal). regionalmente3,4. Sin embargo, queda por demostrar si el flujo del LCR a los linfáticos meníngeos es segmentario, es decir, si las rutas segmentarias vertebrales son tomadas por separado por los canales linfáticos en las divisiones segmentarias vertebrales. Según dos informes recientes, existen dos posibilidades. En una sugerencia, los linfáticos cerebrales fluyen desde la cavidad nasal a los ganglios linfáticos cervicales profundos (como parada secundaria) a través de los ganglios linfáticos cervicales superficiales y los linfáticos meníngeos cerebrales fluyen directamente a los ganglios linfáticos cervicales profundos (como parada primaria), por lo que los linfáticos vertebrales salen del espacio subaracnoideo segmentario vertebral, con el ganglio linfático sacro como parada primaria y el ganglio linfático ilíaco como parada secundaria27. En otra sugerencia, como cada vértebra tiene sus vasos linfáticos epidurales hacia los ganglios linfáticos paravertebrales más pequeños, como lo indicó un estudio vDISCO de cuerpo entero en ratones con montaje/imagen transparente30. Al menos una larga columna de muchos segmentos vertebrales con vasos linfáticos epidurales podría conectarse con las salidas de la duramadre y formar ganglios linfáticos primarios en sus proximidades. Estas vías de drenaje distributivo también podrían desempeñar el papel de puertas para la vigilancia inmune adaptativa contra los desechos y desechos derivados del cerebro y la médula espinal38. Un informe reciente mostró sorprendentemente que los linfáticos meníngeos eran la ruta para que los astrocitos senescentes se desplegaran en el sistema inmunológico sistémico39.

Además de la disminución y el retraso en el drenaje del LCR a los vasos linfáticos en ratones de edad avanzada, también visualizamos claramente los ganglios linfáticos cervicales y sacros. Estos hallazgos subrayaron el significado fisiológico de la intercomunicación entre el parénquima cerebro/médula espinal y los ganglios linfáticos regionales, pero ¿cómo se comunican estos ganglios linfáticos con el sistema inmunológico central, es decir, la médula ósea del cráneo y las vértebras? Cai et al. descubrieron la conexión venosa entre el seno de la médula ósea del cráneo y el seno venoso de la duramadre40, lo que podría actuar como una buena vía de conexión entre estos dos sistemas centrales, neuro e inmunológico, del parénquima cerebro/médula espinal y la médula ósea del cráneo/vértebras. Se sabe que las células mieloides/linfoides conmutan entre la médula ósea del cráneo y las vértebras y el parénquima cerebral a través del LCR3,4. Los ganglios linfáticos son la estación intermediaria de la información contenida en las macromoléculas o células del LCR en todos los niveles del cerebro y segmentos de la médula espinal. Kwon et al.16 y Ma et al.27 informaron explícitamente la vía de drenaje sacro en animales, y Jakob et al.38 visualizaron los canales linfáticos epidurales de las vértebras, que drenan los solutos del LCR a los ganglios linfáticos regionales39. Por lo tanto, los canales linfáticos epidurales paravertebrales hacia los ganglios linfáticos cercanos ahora se agregan para cada segmento vertebral32 además de las rutas nasales y los linfáticos meníngeos hacia los ganglios linfáticos cervicales superficiales y profundos. En nuestro estudio de [64Cu]Cu-albúmina mediante PET, se evaluó el drenaje linfático segmentario del LCR en una instantánea de la lectura visual en serie de las imágenes MIP (Película complementaria 2). A través de estas vías, los solutos macromoleculares y las células cerebrales o de la médula espinal senescentes/lesionadas pueden alcanzar la inmunidad innata/adaptativa del sistema inmunológico. Se necesitan más estudios de visualización para una comprensión más detallada de la cinética del contenido del LCR de esta comunicación segmentaria, revelando así el significado del circuito cerrado de vigilancia inmune del cerebro, la médula espinal y los ganglios linfáticos regionales.

La PET que utiliza [64Cu]Cu-albúmina nos permite visualizar y cuantificar más fácilmente el drenaje linfático del LCR, lo que proporciona ventajas sobre otras modalidades de imágenes. Otros estudios de imágenes con radionúclidos muestran un fondo relativamente alto porque los radiofármacos marcados con radionúclidos se administran por vía intravenosa; sin embargo, en este estudio administramos el marcador por vía intratecal, es decir, dentro de un compartimento. La administración intratecal puede mostrar el mejor contraste y se ha utilizado durante décadas en la cistografía y cisternografía miccional con radioisótopos clínicas. No se detecta radiactividad en el cuerpo, especialmente en las proximidades, antes de la inyección intratecal de [64Cu]Cu-albúmina. La alta relación señal-ruido de la cisternografía PET con albúmina marcada con radioisótopos intratecal permite evaluar cualitativa y cuantitativamente estructuras pequeñas como los ganglios linfáticos cervicales, sacros o ilíacos profundos, incluso en ratones. Se encontró radioactividad caliente en los ganglios linfáticos cervicales superficiales, lo que refleja el drenaje linfático del LCR a través de la cavidad nasal6,7,17,41 y la proporción sostenida de actividades de los ganglios linfáticos cervicales superficiales y los ganglios linfáticos cervicales profundos 9 min y 1/2/4 /6/24 h después de la inyección. Los tractos linfáticos cervicales conectan los ganglios cervicales superficiales y profundos42, y los vasos linfáticos meníngeos craneales pueden drenar directamente a los ganglios linfáticos cervicales profundos1,2,6,7. Debido a que se utilizó albúmina (65 kDa) como sustituto de tau extracelular (LCR) (aprox. 60 kDa) o beta amiloide (100-150 kDa), se observó radioactividad sostenida, incluso a las 24 h, en la imagen de los ganglios linfáticos. sugiere que las proteínas patológicas que salen del LCR a los ganglios linfáticos centinela del SNC estarían expuestas a vigilancia inmune sistémica, es decir, células mieloides procesadoras/presentadoras de antígenos y células inmunes adaptativas en los ganglios linfáticos.

En la literatura se han asociado varias enfermedades con un drenaje linfático disfuncional del LCR41,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52, incluida la hemorragia subaracnoidea (HSA)36 y la hemorragia intracerebral44 en modelos de ratón, que mostró drenaje de eritrocitos y solutos sanguíneos a través de vías de drenaje linfático meníngeo/LCR. Por el contrario, el hematoma subdural puede45 o no44 drenarse a través de los vasos linfáticos meníngeos. Los tumores cerebrales también pueden eliminar sus componentes a través de los vasos linfáticos meníngeos hacia los ganglios linfáticos cervicales para invocar inmunovigilancia46, y la lesión cerebral traumática se ha asociado con disfunción linfática meníngea47. Las enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Alzheimer (EA), se han relacionado con la disfunción del drenaje linfático, y se sabía que la ligadura profunda de los ganglios linfáticos cervicales35 empeoraba la patología de la EA en modelos de ratón49, lo que podría revertirse mediante ultrasonido enfocado50 o estimulación eléctrica theta burst del cerebro45. La ablación linfática con el químico Visudyne25,31,43,52 también empeoró la patología de EA o HAS. Además, la disfunción linfática meníngea puede estar asociada con el factor de crecimiento endotelial vascular C (VEGF-C) y una anomalía de la linfangiogénesis asociada31,41,46. La discrepancia podría deberse en parte a la sutileza de la disfunción linfática meníngea que exige un examen meticuloso del drenaje linfático del LCR. En modelos de animales pequeños como el ratón, debemos utilizar el menor volumen de contraste en la administración intratecal, independientemente del material de contraste. En este estudio, identificamos el material apropiado, la [64Cu]Cu-albúmina, el volumen y la velocidad de inyección para la administración intratecal.

Con el mismo propósito de comprender el drenaje linfático del LCR, estudios pioneros1,2,14 utilizaron imágenes de microscopía fluorescente ex vivo para visualizar/cuantificar el flujo/reflujo paravascular de la intracisterna magna inyectada con tintes fluorescentes. Los investigadores encontraron la dependencia del tamaño del drenaje linfático del LCR14,15, así como del influjo a través de los espacios perivasculares desde el espacio subaracnoideo19, que supuestamente difieren entre ratones jóvenes, de mediana edad y viejos. Como se esperaba, los ratones jóvenes tuvieron una penetración perivascular más profunda de los materiales inyectados dentro de la cisterna magna, como el dextrano marcado con colorante fluorescente (3 kDa) o la ovoalbúmina (45 kDa)19. Estos hallazgos fueron reproducidos en un estudio multicéntrico escrito por Mestre et al.53 pero cuestionado por Smith et al. por su interpretación mecanicista del drenaje del espacio de líquido intersticial54. A pesar de estas ideas competitivas de convección/advección a través de un mecanismo glifático o difusión a través de cualquier espacio de líquido intersticial, el espacio perivascular entre las membranas basales de la glía limitante y el endotelio capilar es crucial en condiciones fisiológicas para el flujo de desechos/desechos del cerebro/médula espinal intersticial parenquimatosa. espacio líquido al LCR. Estudios con contrastes intratecales de gadolinio, principalmente gadobutrol (450 Da), realizados en ratones o ratas, incluso han puesto de relieve diferencias sutiles en el flujo de entrada al espacio perivascular, mostrando efectos sobre este flujo linfático durante la anestesia o el sueño22,23,26,55,56, 57,58. Sin embargo, a diferencia de los estudios microscópicos fluorescentes iniciales, el reflujo perivascular encontrado en estos experimentos de resonancia magnética no fue tan profundo y solo se observó una infiltración superficial, especialmente en ratas55,56,57,58.

Los principales factores de confusión de estos estudios fueron la inyección intracisterna magna (a pesar de la presión intracraneal normal confirmada en el monitoreo) versus la inyección intratecal y la cantidad fraccional mayor de contraste (relativamente en ratones) versus la cantidad fraccional más pequeña de contraste (en ratas) y la cantidad mayor. de contraste fluorescente en microscopía fluorescente ex vivo/in vivo versus la cantidad relativamente menor de contraste (gadobutrol) en MRI. Entre estas cuestiones, planteamos la hipótesis de que el volumen era el principal factor de confusión. Debido a que no observamos ninguna actividad en los ganglios linfáticos con 99mTc-DTPA (tomografía computarizada por emisión de fotón único con pentaacetato de dietilentriamina), se eligió albúmina (65 kDa), en una cantidad mínima, como el candidato óptimo para la mayoría de los exámenes fisiológicos. En nuestro estudio estudio, no pudimos observar el influjo perivascular del parénquima cerebral en la PET con [64Cu]Cu-albúmina, por lo que abandonamos la evaluación linfática, especialmente en la disminución relacionada con la edad del drenaje linfático linfático o intersticial del LCR, que había sido estudiado previamente invirtiendo el flujo fisiológico tras la administración intra-cisterna magna con un volumen mayor (10 a 15 μL) a una velocidad tolerable, pero alta (1 a 5 μL/min) (Tabla complementaria 2). de radiotrazador tanto como sea posible a una velocidad de 0,3 μL/min, pero observamos estancamiento en el espacio intratecal del sitio de inyección, sin movimiento hacia la cisterna basal, impidiendo seguir el camino de drenaje linfático del LCR para llegar a los ganglios linfáticos. . Como se describió anteriormente, en ratones, la velocidad óptima fue de 0,7 μL/min para un volumen total de 6 μL (Figura complementaria 3)18.

El flujo linfático desde los ganglios linfáticos primarios a los secundarios sigue siendo poco conocido. Como se indicó anteriormente, al igual que los ganglios linfáticos cervicales superficiales y profundos, los ganglios linfáticos sacros e ilíacos aparecieron al mismo tiempo después de la administración intratecal en nuestras imágenes PET seriadas. Contrariamente a la interpretación de Ma et al.27 de que el LCR de la columna sacra fluye hacia los ganglios linfáticos sacros como primera parada y luego a los ganglios linfáticos ilíacos que son el centro colector, en nuestro estudio parecía que los ganglios linfáticos sacros drenaban el LCR. de los linfáticos epidurales sacros y los ganglios linfáticos ilíacos drenaron el LCR de los linfáticos epidurales lumbares. Sospechamos que los ganglios linfáticos ilíacos funcionan como el sitio de recolección del drenaje linfático segmentario vertebral de las espinas adyacentes y también la linfa eferente fluye desde los ganglios linfáticos sacros, como una fuga local de albúmina hacia los tejidos lumbosacros. Si se recapitula con los siguientes estudios sobre estudios PET en modo lista en puntos de tiempo anteriores (inmediatamente a 1 h después de la inyección), este hallazgo propondrá la estructura jerárquica de los ganglios linfáticos pre/paravertebrales que cubren toda la longitud del cráneo y las vértebras con la posible comunicación bidireccional entre el sistema inmunológico sistémico y el sistema nervioso central. Hosang et al. informaron recientemente que la inflamación infecciosa de los pulmones afectaba los estados de la microglía de la médula espinal torácica59. Asimismo, la composición compartimentada entre las estructuras inmunes (ganglios linfáticos) y los segmentos de la médula espinal y el cerebro puede ser la plataforma general de la periferia para la interacción del SNC, especialmente el intestino con el microbioma y el cerebro/médula espinal4,60,61. La PET con [64Cu]Cu-albúmina ayudará a examinar, de la forma más no invasiva posible, la cinética del drenaje linfático del LCR hasta 24 h después de la administración intratecal, sin manipulación adicional ni con imágenes repetidas, ya que este método reveló que existía un deterioro relacionado con el envejecimiento. en ratones de envejecimiento normal sin mucha variación entre ratones individuales por actividad de los ganglios linfáticos sobre el% de ID de la actividad espacial del LCR en imágenes de 24 h (Fig. 2G).

La limitación de nuestro estudio PET actual es que no mostró evidencia directa de que el LCR cruce la capa de células de la barrera aracnoidea para llegar a los vasos linfáticos de la duramadre. En cambio, mostró que la albúmina exógena cargada intratecalmente llega a los ganglios linfáticos paravertebrales. Ma et al.25 no pudieron observar la absorción aparente de dextrano fluorescente en los vasos linfáticos durales dentro del cráneo y razonaron que la unión estrecha de las células de la barrera aracnoidea habría impedido el drenaje. Se demostró que la vaina perineural y los linfáticos debajo de las placas cribiformes y la raíz del nervio espinal y los linfáticos epidurales son las vías del LCR hacia los linfáticos sistémicos en los estudios clásicos post mortem o in vivo/ex vivo con tinta/tinte/contraste en animales62,63,64. sesenta y cinco. Sin embargo, estudios de anatomía recientes realizados por Kutomi et al.66 en cerdos y Mollgard et al.67 en ratones revelaron que la capa de células de la barrera aracnoidea permite cruzar fluidos y macromoléculas a través de espacios como la fisura y los espacios durales similares a la granulación aracnoidea craneal en cerdos66 o subaracnoideos. estructuras parecidas a vellosidades en ratones67. Ausencia de claudina 11, una molécula de unión estrecha de la capa de células de barrera aracnoidea alrededor de la membrana linfática subaracnoidea yuxtapuesta (SLYM) y la vena del seno sagital de la duramadre craneal67. Al menos en el ratón, asumimos que el líquido del LCR y/o las macromoléculas pasan a través de los espacios de la capa de células de la barrera aracnoidea para llegar a los vasos linfáticos de la duramadre. Como ya se ha demostrado que los cerdos pueden pasar a través de espacios similares a los de granulación aracnoidea, aún quedan estudios en monos, primates y humanos. La disminución de los vasos linfáticos meníngeos relacionada con la edad también estaría acompañada por la conocida patología de los vasos linfáticos sistémicos, como (1) disminución de la contractilidad de los vasos linfáticos, (2) hiperpermeabilidad basal y, por lo tanto, reducción de la capacidad de respuesta inflamatoria y (3) respuesta inmune retardada68. Los vasos linfáticos meníngeos y su contribución mecánica a la disminución del drenaje linfático del LCR con la edad deben dilucidarse más.

En el futuro, las relaciones de causa y efecto y su importancia terapéutica deberían probarse mediante imágenes repetidas de animales pequeños en condiciones fisiológicas utilizando sofisticadas PET/tomografía computarizada (CT) o PET/MRI. Estos métodos utilizan pequeñas cantidades de radiofármaco, evitando cualquier preocupación por la toxicidad o la perturbación del estado estacionario de los animales. Los modelos animales de lesión cerebral traumática, hemorragia intracerebral/subaracnoidea o incluso ciclos de envejecimiento/sueño/circadianos deben acompañarse en varios niveles, grados de gravedad o momentos temporales para modelar el curso de la enfermedad en animales individuales. Los modelos de neuroinflamación o demencia también deben observarse repetidamente durante el curso de la enfermedad, incluso a los 3/7/12/18 meses de edad. Para estos estudios en múltiples puntos temporales, se recomienda la PET con [64Cu]Cu-albúmina cuando se busca comprender los mecanismos fisiológicos y patológicos del drenaje linfático del LCR como productor del principal parámetro candidato del curso de una enfermedad y/o de los resultados de una intervención. La vida media de eliminación y el sustituto de la retención del LCR, %ID a las 4, 6 o 24 h después de la inyección, se proponen como un marcador de anomalía en el drenaje del LCR, de acuerdo con la evidencia de un cambio fenotípico relacionado con la edad que sugiere una eliminación disfuncional del LCR. desperdicio cerebral25. Las actividades de los ganglios linfáticos en la PET con [64Cu]Cu-albúmina de la fase estacionaria anterior y tardía es otro hallazgo interesante que garantiza que la PET con [64Cu]Cu-albúmina muestra drenaje linfático en todos los niveles del cráneo y las vértebras. Estos biomarcadores y los protocolos correspondientes se pueden aplicar para evaluar la respuesta a nuevas estrategias terapéuticas que se sabe que mejoran el drenaje linfático del LCR50,51,52,69.

Los ratones de edad avanzada muestran una vida media de eliminación y una retención del marcador dentro del espacio subaracnoideo significativamente mayores que los ratones adultos. Los parámetros de imagen del protocolo PET utilizado en este estudio se pueden aplicar para evaluar la disfunción linfática y la respuesta después de la mejora terapéutica de la función linfática.

Todos los datos están disponibles en el texto principal o en materiales complementarios. Todos los datos, códigos y materiales utilizados en el análisis están disponibles a través de un acuerdo estándar de transferencia de material con la Universidad Nacional de Seúl para fines académicos y sin fines de lucro comunicándose con los autores correspondientes ([email protected] o [email protected]).

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Agradecemos al Sr. SJ Kwon y al Sr. J Park por su asistencia técnica.

Este trabajo fue financiado por las subvenciones de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) del gobierno coreano (MSIP) (No. 2017M3C7A1048079, No. 2020R1A2C2101069 y No. 2017R1A5A1015626).

Departamento de Medicina Nuclear, Facultad de Medicina, Universidad Nacional de Seúl, Seúl, Corea

Azmal Sarker, Minseok Suh, Ji Yong Park, Yun-Sang Lee y Dong Soo Lee

Departamento de Medicina Nuclear, Hospital Universitario Nacional de Seúl, Seúl, Corea

Minseok Suh, Yoori Choi, Ji Yong Park, Yun-Sang Lee y Dong Soo Lee

Centro de Investigación Biomédica, Hospital Universitario Nacional de Seúl, Seúl, Corea

Minseok Suh y Yoori Choi

Departamento de Medicina Molecular y Ciencias Biofarmacéuticas, Escuela de Graduados en Ciencia y Tecnología de Convergencia, Universidad Nacional de Seúl, Seúl, Corea

Yoori Choi y Dong Soo Lee

Centro de Investigación Médica, Facultad de Medicina, Universidad Nacional de Seúl, Seúl, Corea

Dong Soo Lee

Ciencias Médicas e Ingeniería, Escuela de Ciencia y Tecnología de Convergencia, Universidad de Ciencia y Tecnología de Pohang (POSTECH), Pohang, Corea

Dong Soo Lee

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AS: Metodología; Investigación; Visualización; Redacción-borrador original. MS: Conceptualización; Metodología; Investigación; Visualización; Supervisión; Redacción-borrador original; Escritura-revisión y edición. YC: Metodología; Investigación; Supervisión. Parque JY: Metodología; Investigación. YSL: Metodología; Investigación. DSL: Conceptualización; Metodología; Investigación; Visualización; Adquisición de financiación; Administración de proyecto; Supervisión; Redacción-borrador original; Escritura-revisión y edición.

Correspondencia a Minseok Suh o Dong Soo Lee.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Sarker, A., Suh, M., Choi, Y. et al. La PET intratecal con [64Cu]Cu-albúmina revela una disminución del drenaje linfático del líquido cefalorraquídeo relacionada con la edad. Informe científico 13, 12930 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39903-y

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Recibido: 18 de marzo de 2023

Aceptado: 01 de agosto de 2023

Publicado: 09 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39903-y

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